背景及概述

多肽具有一个显著的结构性优势，即可以在不影响原有功能性多肽片段的基础上，通过固相合成或生物合成，在多肽的一端或两端引入新的功能性多肽序列，获得多功能性融合肽。 这种具有受体/配体结合能力的pH 敏感脂质体进入细胞的机制，往往不同于普通脂质体的融合方式。如类似ＲGD/αV β3或者Transferrin /TfＲ的结合方式，会诱导肿瘤组织细胞主动内吞脂质体继而释放药物/核酸，此类多肽修饰的pH 敏感脂质体药物/核酸释放过程。常见的多肽修饰物按照修饰位点可分为四大类：C 末端修饰(酰胺化、硫酸酯化等)、N 末端修饰(乙?；?、脂肪酸化等)、中间残基修饰(与Se r-、Ty r-、A sn-、Thr-结合的糖基化修饰；与Ser-、Ty r-、Thr-结合的磷酸化修饰等)以及环化修饰。目前对多肽修饰的研究已经成为热点。

修饰方法

1.化学法

是目前多肽修饰中研究最为成熟、应用最为广泛的修饰方法，它主要包括液相法和固相法。

1）液相法

液相法是一种经典的方法，在纯度监测和规?；确矫婢哂卸捞赜攀?。在肽的环化修饰中，为避免发生分子间反应生成线性或环状的二聚体和多聚体，反应需要在高度稀释的溶液中进行(10-3 ～10-4 mol/ L)。但在此高度稀释的条件下，常存在反应时间延长、副反应较多等局限性，给后处理增加不便。针对这种情况，使用一种空间位阻大的树突状硅烷取代碳二亚胺作为缩合剂，代替常规试剂二环己基碳二亚胺(DCC)进行溶液方式的内酰胺环肽合成，得到纯度很高的目标化合物。

2）固相法

固相法因为易于分离纯化而广泛应用在肽修饰中，采用此法合成的肽修饰物其产率和分离纯度也明显高于采用液相法。在固相肽合成中，C 末端氨基酸残基与载体相连后再组装剩余氨基酸，对合成C 末端修饰肽存在着先天障碍。选用相对普通的2-氯三苯甲基氯树脂为载体，固相合成全?；る牧帘鹆?/span>(Py r-Hi s-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-eu-A rg-Pro-NHEt)，25 ℃下乙胺化反应5 min 后直接切割侧链，实现了肽片段乙胺化和侧链切割步骤的连续耦合进行，避免了中间产物的分离纯化，成功为其他C-末端多肽修饰提供借鉴。

3）酶法

酶在修饰位点的立体选择性和温和快速高效的合成反应条件等方面具有极大的优势。在糖肽合成中，糖基氨基酸经酶促缩合反应接入寡肽，然后用糖基转移酶完成进一步的寡糖修饰，这种酶促反应可以在水溶液中进行，并且只需要最小限度的?；?。但是酶存在着来源单一，不易获取等局限性。此外底物中肽链氨基酸顺序有可能会影响其修饰效率，以酶法将半乳糖胺连接到肽段上合成糖肽时，发现反应的产率取决于底物的结构和糖基化两个因素，普遍较低。随着DNA 技术的发展和研究的不断深入，酶将在肽修饰中发挥越来越重要的作用。

4）化学酶法耦合

采用化学和酶法相结合的化学酶法来进行肽修饰研究，可减少化学试剂的过量使用带来的污染，同时也保证了温和条件下酶催化的产率。固相合成N 端共轭糖基内***肽-1 衍生物，再在糖基转移酶的催化下将N-乙?；坊咸腔衔锪拥交Хê铣傻奶请纳?，形成目标产物N端三糖肽内***肽-1 类似物，此合成过程只需最小限度的?；?。以修饰的硅胶为固相载体，此载体上用化学法快速合成肽键并酶法合成糖苷键，成功合成Sialyl lew is x 抗原。

2.多肽修饰的策略

多肽修饰过程中，通常采用总体缩合策略、单元构建策略以及天然化学连接。针对修饰过程中肽链的缩合与不同的修饰化基团的结构之间相互影响，常采用不同的策略。

1）总体缩合策略

总体缩合策略，是指将已制备的多肽链与目标修饰剂催化结合，以避免肽链延长过程中所用试剂对修饰剂与肽段连接效率的影响。以糖肽为例，在缩合过程中，先分别合成多肽和寡糖，再将多肽受体与寡糖供体缩合形成N-或O-糖肽。此策略可避免肽链延长过程中酸性去?；ぬ跫?/span>O-糖苷键的影响。但是直接糖基化肽链中的丝氨酸或苏氨酸还存在着很大的困难，尝试了在树脂上的固相糖基化反应，合成采用端基连接烯丙基氨基甲酸酯的乙?；；て咸烟?，与树脂上连有苏氨酸残基的三肽发生反应，Pd 催化切除后，发现以64 %收率回收原料，而产物总收率只有4 %。目前此策略主要应用在糖基和天冬酰胺相连的N-链接糖肽中。

2）单元构建策略

单元构建策略是指先制备不同修饰基团的单元，再将逐个单元催化耦合。在糖基化修饰过程中，由于氨基酸与糖之间的糖苷键在肽链延长之前已形成，位点与立体选择较易控制，目前已成为合成的常用方法，特别适用于固相合成法和合成含有多个糖基的糖肽。此策略需预先在液相中合成糖基化氨基酸，已研制出葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、GlcβGlc 、Man 、拟糖物、核糖等与天冬酰胺相连接的构建单元。引进微波技术合成Fmoc-L-A sn(GlcA c4)，缩合时间从16 ～ 24h 缩短至5 min(100W ，70 ℃)，极大地方便了N-糖肽的合成。在策略的选择上，采用Fmoc 固相合成策略研究磷酸化血管紧张素Ⅱ 的合成，选择N ，N-二乙基-二叔丁氧基亚磷酰胺为磷酸化试剂。总体磷酸化法选用侧链羟基未?；さ睦野彼嶙魑滔嗪铣傻牡ヌ褰须牡暮铣?。磷酸化单体Fmoc-Tyr(PO3 But2)-OH 为单体进行肽的合成。采用总体磷酸化法和磷酸化单体法都得到了所需要的磷酸化血管紧张素Ⅱ 。采用总体法不但能够得到磷肽，而且也得到了非磷酸化的多肽，但是磷酸化效率低，产率约为17 %，粗品肽较难分离。而单体法提供了更为直接的合成步骤，合成效率更高，副产物较少，而且产率可达到38 %，因此认为合成包含磷酸化酪氨酸的多肽采用磷酸化单体法更好。

3.天然化学连接

采用固相合成时，往往只能得到得到少于50 个氨基酸的肽修饰物，并且当肽链上有多个修饰位点，采取以往的策略往往有很多困难。针对这种局限性，发展了一种有效片段连接方式：天然化学连接(NCL)。它是指在C 端的肽硫酯和一个N 端未?；さ陌腚装彼岵谢饔?，形成一个天然的半胱氨酸将两个片段连接起来。选用链烷磺胺作为连接手臂来获取C 端肽硫酯，利用NCL 策略将2 个糖肽片段连接成具有82 个残基结构的抗菌糖蛋白伏蝇素。在环肽的合成中应用固相多肽合成方法，以Boc/Bzl 策略由C 端向N 端逐步延长肽链，得到线性肽硫酯的肽树脂。经裂解、纯化的线性肽硫酯，在N aHCO3 水溶液，通过硫内酯自发地经过S 原子到N 原子的?；ㄒ贫纬苫冯?。类型肽修饰物种类繁多，这里主要介绍几种最主要的肽修饰物的最新研究进展。

1）PEG-肽结合物：目前在肽类化合物的PEG 修饰研究中应用最为普遍的是单甲氧基聚乙二醇(mPEG ：CH3O-(CH2-CH2O)n-H)。该修饰先在mPEG 的末端引入羧基、氨基等活性基团，或者制备经mPEG 修饰的氨基酸衍生物，再利用固相或液相法将其偶联到肽序列中去，从而实现对多肽的N 端、C 端及某些氨基酸侧链的聚乙二醇化修饰。研究不同的PEG 相对分子质量和不同的连接方式对PEG 化的胰岛素的生物活性和耐热稳定性的影响，实验中选取了相对分子质量为1100 、2000 、5000 g/mo l 的三种mPEG ，然后分别经过琥珀酸酐(SA)、氰尿酰氯(CC)、对***磺酰氯(TC)活化，结果发现修饰后的胰岛素的生物活力有所降低，但经较高相对分子质量的mPEG 修饰的胰岛素对酶与底物的结合位点表现出更大的亲和力，耐热稳定性明显提高，且胰岛素经过氰尿酰氯活化的CC-mPEG(5000 g/mo l)修饰后具。近年来，随着PEG 化化学研究的逐渐深入，异端双功能基PEG 衍生物在肽化学上也有了重要应用，将PEG 两端分别进行DMT 和Fmo c ?；?，其中DMT 端接寡核苷酸链，Fmoc ?；ざ私与?，采用液相法得到寡核苷酸-PEG-肽的结合物。在PEG 的末端采用固相合成策略成功引入羧基，合成奥曲肽-PEG- DSPE(二十八烷酰磷脂酰乙醇胺(脑磷酯))。虽然合成多肽的PEG 修饰在方法学上取得了一定的进展，但在实际操作中还是存在问题。由于PEG 是一种聚合物，相对分子质量不能确定。由于多肽修饰的PEG 相对分子质量通常为5000 至20000 ，固相合成法中修饰多肽难度较大，反应速率很慢且产率很低。因此可考虑在液相中修饰，但这势必会增加后处理次数，对产物的生物活性将造成不利的影响。

2）糖肽

多肽糖基化修饰后的产物称为糖肽，可作为模型工具在糖蛋白的结构和功能的科学研究上发挥重要作用。因此，糖肽的合成就显得尤为重要。目前寡糖和多肽链之间的连接键主要有C-、N-、O-和S-糖苷键，其中N-、O-糖苷键应用最普遍。糖苷键在化学上的不稳定性大大增加了肽合成的复杂性。糖苷键通?；嵩谒嵝蕴跫滤?，而且对于所有的糖基丝氨酸和苏氨酸衍生物，即使是在碱性很弱的条件下，也有发生β 消除反应的可能性。N-连接糖基化可以引入一糖胺，通过酰胺与羧基结合来?；ぬ於０?，这种方法不需要特别的?；ぬ腔螂?，并且可以通过糖胺与多肽链中的天冬酰胺残基结合而得到N-连接糖肽。在O-连接糖肽的合成中，丝氨酸和苏氨酸的羟基作为糖基的受体，需要对糖和肽进行?；?。选择性地脱除糖基氨基酸或糖肽的?；せ?，仍是一个很长时间都没有解决的问题，尽管这个问题早在20 世纪70 年代末就已经提出来了，在不破坏糖苷键的条件下，β-糖基氨基酸衍生物的Z 基用HBr/AcO H 不能脱除。尽管在一定条件下脱除Boc 残基是可以实现的，但在糖肽合成中，酸性条件下的脱?；し从θ孕柘冉凶邢傅暮饬?。正如所提及的，对碱敏感的糖基丝氨酸或苏氨酸衍生物(β 消除反应)进一步限制了脱?；さ姆从Ψ段?。因此，?；せ荒茉谖潞偷幕蛑行缘姆从μ跫陆型殉?。

3）磷肽

蛋白质的磷酸化和去磷酸化几乎调节着生命活动的所有过程，包括细胞的增殖发育和分化、神经活动、肌肉收缩、新陈代谢和肿瘤发生等，而磷肽则是体现其母体蛋白磷酸化过程结构变化的最好模型。根据磷酸化氨基酸残基的不同，可将磷酸化多肽分为四类，即N-磷?；嚯?、O-磷?；嚯?、?；姿犭暮?/span>S-磷?；嚯?。O-磷?；嚯氖峭ü腔被岬牧姿峄纬傻?，如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸、羟脯氨酸或羟赖氨酸磷酸化；N-磷?；嚯氖峭ü彼?、赖氨酸或组氨酸的磷酸化形成的；?；姿犭氖峭ü於彼峄蚬劝彼岬牧姿峄纬傻?；而S-磷?；嚯脑蛲ü腚装彼崃姿峄纬?。磷肽合成的常用方法是将合成好的未被磷酸化的多肽与在磷酸激酶的作用下进行酶法磷酸化，但是该法对于不能被磷酸激酶磷酸化的多肽并不适用，迄今为止，磷肽及其类似物的化学合成仍非易事。采用"一锅"法用三氯氧化磷将L-亮氨酸活化72 h ，然后用1 、4 二氧杂环乙烷将其冷却，再加入二异丙氧基亚膦酸酯(DIPPH)和次氯酸钠(NaClO)，混合后反应，得到N-磷酸化同源肽，而异源肽及其磷酸化也正处于研究中。

4）环肽

较短的线性肽在生物体内易被各种生物酶迅速降解，形成环肽可提高肽的酶和化学稳定性。由于环肽没有C 端和N 端，可消除或降低氨肽酶和羧肽酶的降解作用，从而提高了肽的抗酶解能力；同时由于形成环状结构，增加了对构象的限制性，有可能增加肽与受体的亲和力及选择性，提高活性，减少副作用，是近年来新药开发的新方向?；冯目煞治嚼?，一类为均环肽，氨基酸之间均以酰胺键相连；另一类为杂环肽，结构中除酰胺键外还有酯键、醚键、硫酯键和二硫键等。

A：均环肽

均环肽实质是形成分子内肽键的过程，其影响成环因素是环的大?。汉吒霭被岵谢陨系亩嚯亩寄芩忱苫?，六肽、五肽乃至更小的环肽合成很困难。选择从云南繁缕中分离的一个环五肽(Gly-Ala-Tyr-Leu-A la)为模型肽，以其研制的有机磷化合物DEPBT 为缩合试剂分别用液相法和固相法合成了两个不同线型肽前体，并仍以DEPBT 作为缩合试剂完成了他们的环化反应，得到了预期的环五肽，但是产率只有6 %和6 .5 %，处于很低的水平，并分析得出环五肽的合成关键在于抑制环十肽的生成。

B：杂环肽

杂环肽的氨基酸残基之间存在的非酰胺键主要是酯键和二硫键，前者形成过程与酰胺键类似，后者合成过程与均环肽迥异，实质为利用氧化剂将两个Cys 的巯基氧化成-S-S-键。目前在多肽二硫键的合成过程中，多采用先将含有巯基的还原型多肽从树脂上裂解下来，再在液相中氧化环合得到。成环方法主要有DMSO 法、铁***法、碘氧化法、空气氧化法和谷胱甘肽氧化法等，而在树脂上直接氧化成二硫键则鲜有文献报道，以Rink Amide-MBHA 树脂为载体，采用Fmoc/tBu 正交?；す滔嗪铣刹呗?，运用微波照射促进，先快速高效地合成得到载有催产素或赖氨加压素还原型多肽的树脂，再将连接在树脂上的各还原型多肽分别在微波促进条件下和常温条件下通过碘氧化法环合形成二硫键制得环肽。这种合成此类环肽的方法具有快速高效和纯化方便的优势，整个环肽的合成流程只需数小时，为此类环肽的大规模生产奠定了基础。

主要参考资料

[1] 多肽修饰的pH 敏感脂质体研究进展

[2] 多肽化学修饰的研究进展

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